En el año 2000, al ser nombrado Juan Carrete director del Centro Cultural Conde Duque de Madrid, se creó en este centro el Aula de Arte Digital, en la que colaboraron entre otros Rafael Peñalver, Pepe Isla y José Luis Brea. Juan Carrete había sido hasta entonces el director de la Calcografía Nacional de Madrid, donde en 1999 el equipo del Gabinete de Estudios había creado el programa Estampa-digital I+D para aplicar la tecnología digital al grabado y a la estampación.

Tras la celebración de la exhibición Cibervisión 02: Dinámicas Fluidas en marzo de 2002, el proyecto tomó un nuevo rumbo como un programa estable dentro del Centro Cultural Conde Duque. Bajo el nombre MediaLabMadrid y la dirección de Karin Ohlenschläger y Luis Rico se puso en marcha un amplio programa de actividades de formación, investigación, producción, debates y exposiciones centradas en el fomento del diálogo entre arte, ciencia, tecnología y sociedad. Estas actividades sirvieron para impulsar la emergente cultura digital en el ámbito de Madrid y para establecer relaciones entre diferentes actores de la comunidad local y favorecer su conexión con circuitos nacionales e internacionales.

A través de la celebración de varias exposiciones de alcance internacional -Banquete. Metabolismo y comunicación (2003), Banquete. Comunicación en evolución (2005) o Digital Transit (2006)- y la puesta en marcha de proyectos de investigación, MediaLabMadrid exploró conceptos de la biología en combinación con otros provenientes de las ciencias sociales, la computación o las ciencias de la complejidad para desarrollar una dinámica transdisciplinar de producción y transferencia de conocimiento.

Las investigaciones y producciones resultantes de esta etapa recibieron reconocimiento internacional, presentándose en contextos como el Ars Electronica Center de Linz, el ZKM/Center for Art and Media de Karlsruhe, el certamen VIDA de la Fundación Telefónica en Madrid, el Sónar de Barcelona o el File de Sao Paulo.

En 2006, desde el programa educativo y de mediación cultural se organizó la primera edición de Interactivos?, un formato de taller de producción colaborativa que tras la salida de Karin Ohlenschläger y Luis Rico como directores del centro supuso la base para una nueva etapa en la que, continuando la trayectoria anterior se pone un mayor énfasis en la participación de la ciudadanía en los procesos de investigación y producción de proyectos culturales. En este año se da también un impulso al programa de mediación cultural, que desde entonces ha sido un eje vertebrador de toda la actividad del centro.

En septiembre de 2007 el programa se trasladó a la Plaza de las Letras, en los bajos de la antigua Serrería Belga, adoptando el nombre de Medialab Prado en alusión a su nueva ubicación y bajo la dirección de Juan Carrete, que dejó entonces la dirección del CCCD. En este local de unos 150 m2 desarrolló una intensa actividad durante casi seis años, durante los que consolidó su modelo basado en las convocatorias abiertas para la recepción de proyectos sobre diferentes líneas temáticas (Interactivos?, Visualizar, Inclusiva-net, Avlab y Laboratorio del procomún”) y en la producción colaborativa e interdisciplinar. Medialab Prado amplió su prestigio internacional a través de sus convocatorias y de la replicación de sus formatos de trabajo en colaboración con organizaciones de todo el mundo.

Tras un paso temporal por Matadero Madrid en 2012 y la salida de Juan Carrete ese mismo año, el programa se traslada en abril de 2013 al edificio de las Antiguas Serrerías Belgas, rehabilitado por los arquitectos Langarita-Navarro. Desde 2014 el cargo de director lo ocupa Marcos García, quien había sido uno de los responsables del programa cultural desde 2006 y que fue seleccionado para el puesto por concurso público. Tras ser seleccionado de nuevo en un concurso convocado por el Ayuntamiento de Madrid en octubre de 2017 para la dirección artística de seis centros culturales municipales, sigue ocupando el cargo de Director Artístico hasta enero de 2021.

Desde el traslado en 2013 a su sede en la Serrería Belga, Medialab Prado tuvo como objetivo mantener el carácter experimental y de laboratorio que había sido su rasgo más destacado, al mismo tiempo que aprovechaba las características y mayor visibilidad del edificio para incorporar a nuevos públicos, usuarios y colaboradores.

Entre 2016 y 2019, Medialab Prado desarrolló un programa de colaboración con el Área de Gobierno de Participación Ciudadana, Transparencia y Gobierno Abierto del Ayuntamiento de Madrid, en el marco del cual se ponen en marcha los programas Inteligencia colectiva para la democracia, Experimenta Distrito o Madrid Escucha, y se da un nuevo impulso a los programas relacionados con datos abiertos Visualizar y Periodismo de datos.

En marzo de 2021 Medialab se traslada a Matadero Madrid y pasa a denominarse Medialab Matadero. En octubre de este mismo año Eduardo Castillo Vinuesa es nombrado nuevo responsable comisarial de Medialab. 

Medialab ha recibido varios premios y reconocimientos a lo largo de su trayectoria. En 2010 recibió una Mención Especial del jurado del festival austríaco Ars Electronica por su modelo de taller Interactivos?. En 2015, OKFN Spain, capítulo local de la organización sin ánimo de lucro Open Knowledge Foundation, otorgó a Medialab Prado el premio a la mejor iniciativa de fomento del emprendimiento desde el conocimiento abierto. En marzo de 2016, Medialab Prado recibe el Premio Princesa Margriet de Cultura de la Fundación Europea de la Cultura. El jurado destacó «el carácter extraordinario» de este proyecto del Ayuntamiento de Madrid por ser «creador de espacios de participación y experimentación política a través de nuevas iniciativas culturales que, desde lo público, implican a la ciudadanía y contribuyen a repensar las instituciones públicas desde dentro».

Así mismo, ha participado en varios proyectos subvencionados por diferentes programas de la Comisión Europea:

LabtoLab

Libre Graphics Research Unit. Proyecto programa Cultura de la Unión Europea (2012-15). Red de investigación liderada por  Constant (Bélgica) y en colaboración con  Worm (Holanda), Piksel (Noruega), que reúne a tipógrafos, diseñadores webs, ilustradores, diseñadores gráficos, cartógrafos, escritores, artistas y programadores, y propone una amplia variedad de actividades, teóricas y prácticas, a través de textos, reuniones de investigación, prototipado experimental, seminarios y talleres.

Connecting Cities. Proyecto programa Cultura de la Unión Europea (2012-15). Colaboración entre centros de arte europeos para explorar el potencial de las fachadas digitales en el espacio público. Coordinado por el Public Art Lab de Berlín, Ars Electronica de Linz, IMAL de Bruselas, FACT de Liverpool, M-Cult de Helsinki, Media Architectur de Viene, Video Spread de Marsella, y el Museo de Arte Contemporáneo de Zagrev y Bis Body Process Arts Assoc. de Estambul.

Doing it Together Science - Proyecto en el marco del programa H2020 de la Comisión Europea . DITOs (Haciendo Ciencia Juntos) propone pasar de un modelo en el que la investigación científica, la innovación y la resolución de problemas están dirigidas por instituciones científicas/profesionales, a uno basado en la participación activa de la sociedad que permita el desarrollo de capacidades con diferentes niveles de implicación en el proceso científico. Está coordinado por el Extreme Citizen Science group del University College of London (UCL) en el que también participan organizaciones de nueve países europeos: European Citizen Science Association, Universite Paris Descartes, la Universidad de Ginebra, Kapelica Gallery / Kersnikova de Eslovenia, Royal Belgian Institute of Natural Sciences, Meritum Association de Polonia y Waag Society de Países Bajos.